Д-р Игорь Краус, АО «НИИ пивоваренной и солодовенной промышленности», Прага.
Инж. Марш Шпунарова, к.н., НИИ сельского хозяйства, Кромержиж
1. Введение
При селекции, сохранении и возделывании сортов пивоваренного ячменя делается упор на то, чтобы они, прежде всего, имели свои специфические свойства, отличающие их от других сортов, чтобы в исследуемых признаках они были гомогенными и постоянными. Если же важнейшие качественные и количественные характеристики понимать как результирующую сложных биохимических процессов, идущих в клетках, тканях и органах растения, то можно ожидать высокой степени гомогенности на уровне биохимических маркеров.
Биохимическими маркерами чаще всего считают молекулы белков, ферментов и нуклеиновых кислот, специфичные тем, что они индуцируют определенные качественные свойства, например сортовую принадлежность, не находятся под действием внешней среды, достаточно полиморфны. Это означает, что в большей части форм обнаруживаются молекулы одинаковых или подобных свойств и они воспроизводимо-аналитически установимы. В качестве биохимических маркеров у пивоваренного ячменя чаще всего используют фракции запасных белков зерновки, экстрагируемые спиртами, такими, например, как гордеины; дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК); изофер-менты, такие, какэстераза [2,3,5].
Можно говорить о гомогенности биохимических маркеров в случае, если у определенного сорта имеется только один тип исследуемых маркеров. Если у сорта обнаруживаются два или более типов, речь идет о сорте гетерогенном по биохимическим маркерам. В этом смысле, следовательно, гомогенность и гетерогенность маркеров понимаются как характеристика сортовой принадлежности. А это означает, что и сорт гетерогенный в биохимических маркерах может проявлять гомогенность по качественному показателю солода или ячменя. Одновременно определяется, являются ли эти маркеры сортос-пецифическими или неспецифическими. Следовательно, исследуемый тип маркера является либо характерным только для одного сорта, либо исследуемые маркеры характеризуют определенную группу сортов в определенной региональной сортовой коллекции, приведенной, например, в Чешской Республике в Государственной книге сортов Ч.Р. [7]. Это означает, что в первом случае сорт в данной коллекции незаменим, а во втором — сорта друг от друга не отличаются.
На примере некоторых знаменитых сортов пивоваренного ячменя чешской и словацкой селекции в статье приведены сорта, отличающиеся сортоспецифической гомогенностью, или гетерогенностью гордеиновых и ДНК маркеров.
2. Материалы и методы
Для исследования гомогенности или гетерогенности биохимических маркеров были выбраны качественные и в свое время широко возделывавшиеся сорта пивоваренного ячменя Акцент (1992), Форум (1993) и Компакт (1995). Образцы сортов брались из сортоиспытаний Центрального сельскохозяйственного контрольно-испытательного института в 1997 году.
Для определения гордеиновых маркеров был использован модифицированный метод ЕВС [1]. Гордеины были экстрагированы из отдельных растертых сухих зрелых зерновок 500 мл 50°/с водного раствора 2-хлорэтанола в течение 3-х часов. Экстракт был отделен центрифугированием при 12 000 мин-1 (15 мин). Выделение гордеинов было проведено вертикальным электрофорезом в 8% полиакриламидном геле (формат 18 х 15 см) в 1 М растворе мочевины. В качестве сепарирующего использовали 0,04% раствор глицина в 0,4% растворе уксусной кислоты. Период сепарации при беспрерывном охлаждении электрофоретиче-ского узла до температуры 8’С соответствовал времени достижения 100000 Вч с постоянным током 40 мА, т.е. приблизительно 18 часам с начальным режимом 10 мА в течение 20 минут. Затем гель был окрашен при постоянном встряхивании: 1-3 часа в 0,1 % растворе Serva Blue R в 12% растворе трихлоруксусной кислоты. Гели сразу же после окраски ополаскивали дистиллированной водой и визуально оценивали на трансиллюминаторе в белом свете. Для целей документирования гели были «запаяны» между целлофановыми пленками сушкой в сушилке с прогонкой горячего воздуха при температуре до 60°С. От каждого сорта для оценки брали 15 зерновок.
Для определения ДНК использовали метод полимеразной цепной реакции (Polymerase Chain Reaction, PCR) с применением преобразованного метода RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) [6]. ДНК изолировали из отдельных растертых сухих зрелых зерновок с использованием установки Plant Dneasy isolation Kit (Qiagen). Для каждого сорта производили оценку 10 зерновок. PCR проводилась в термостате с нагревающейся крышкой (РТС 200, MJ Research) в 25 мкл реакционной смеси с 30 — 35 нг ДНК-матрицы, 1,5 мМ раствором MgCI2, 0,5 микромоля праймера АВ 5,17 с последовательностью нуклеотидных оснований 5’CCAACGTCGTS’ и 1,6 Е Taq ДНК полимеразы в 1х реакционном буферном растворе (Promega). Реакцию вели следующим образом: 45 циклов при температуре 38°С в течение одной минуты, при температуре 72°С в течение двух минут; при температуре 94°С в течение .одной минуты с начальной денатурацией ДНК при температуре 94°С в течение пяти минут и окончательной элонгацией при температуре 72’С в течение 7 минут. PCR продукты были отделены горизонтальным электрофорезом на 2% агарозовом геле (NuSieve3:1) в 1хТВЕ(ТР18-боратный буферный раствор -ЭДТА) сэтидиумбромидом (0,1 мкг/1мл геля) с молекулярным маркером (стандарт).
3.Результаты и обсуждение
Анализом электрофоретического выделения гордеинов у сортов Акцент и Компакт было обнаружено по два типа (А и В) спектров, у сорта Форум — один тип (рис.1). В то время как в случае с сортом Форум речь идет о специфической гомогенности гордеиновых маркеров, у сортов Акцент и Компакт — о неспецифической гетерогенности. Тип гордеина у сорта Акцент А идентичен единственному известному типу у сорта Сладко, а тип сорта Компакт А идентичен единственному известному типу у сорта Толар. Идентичность типов гордеинов у сортов Акцент (Акцент А) и Сладко может следовать из высокой степени родственности (50% через общего родственника — сорт Сало-ме /=HVS 827/). Напротив, специфическому характеру гордеинов у сорта Форум может способствовать проявление в селекции пивоваренного ячменя не слишком часто используемой полудикой эректоидной формы Hortpadsi Ketsoras [4]. Соотношение типов гордеинов сортов Акцент А и Акцент В не было установлено. (Из анализированной коллекции 100 зерновок сорта Акцент — из сортоиспытаний Центрального сельскохозяйственного контрольно-испытательного института в 1998 году был определен только тип гордеина А). Соотношение типов гордеинов сортов Компакт А и Компакт В в образце сорта Компакт, — из сортоиспытаний вышеназванного института в 1998 году установлено на уровне 89%+11% (неопубликованные данные). Относительно низкое наличие минорного типа В у сорта Компакт может в реальных анализируемых образцах (главным образом при низком числе оценок) привести к замене сортом Толар, либо у товарных образцов сорта Толар, которые имели бы минимальное наличие примесей Компакта, возможна неправильная оценка и выводы (при регистрации типа Компакт В) о том, что речь идет о чистосортном образце Компакта.
При оценке ДНК маркеров праймером АВ 5.17 было обнаружено, что только этот праймер характеризуется гомогенностью (в рамках проведенного анализа) у всех 3-х исследованных сортов. ДНК маркер у сорта Акцент равен приблизительно 600 парам оснований и дает возможность отличать эти сорта от сортов Форум и Компакт. Напротив, Компакт неотличим при использовании этого праймера от сорта Форум (рис.2). У обоих сортов были обнаружены сходные ДНК маркеры величиной
приблизительно 900 и 600 пар оснований. ДНК маркеры, обнаруженные посредством праймера АВ 5.17 у сортов Форум и Компакт, нельзя считать специфическими. Из-за низкого числа исследованных сортов затруднительно установление специфичности ДНК маркера, обнаруженного с помощью применения праймера у сорта Акцент. Для взаимного отличия приведенных сортов необходимо использовать другие подходящие праймеры.
Гомогенность биохимических маркеров в случае предполагаемой высокой сортовой чистоты образцов можно использовать для улучшения окончательной оценки анализов при одинаковых материальных затратах и при анализах экстрактов 2-х или более зерновок.
4. Заключение
На примерах известных сортов пивоваренного ячменя чешской и словацкой селекции Акцент, форум и Компакт в статье продемонстрирована сортовая гомогенность и гетерогенность гордеиновых и ДНК маркеров и их специфичность для коллекции сортов, приведенных в списке рекомендуемых сортов. Приведенные примеры подтверждают целесообразность использования гордеиновых и ДНК маркеров для идентификации сортов пивоваренного ячменя, однако их самостоятельное и
отдельное использование не обеспечивает универсального и однозначного подхода к коллекции современных сортов, выращиваемых в Чешской Республике.
Гомогенные биохимические маркеры можно использовать для более эффективной оценки проводимых анализов при идентификации сортов так, что анализы проводятся на экстракте двух или более зерновок.
LITERATURA
[1] BASAROVA, G., et al.: Pivovarsko-sladarska analytika.
Merkanta, Praha 1992
[2] BECKER, J, HEUN, M.: Plant Molecular Biologi 27, 1995, s.835
[3] JONES, B.L, HEISEL, S.: J.Am.Soc.Brew.Chem. 49, 1991, (3), s.93
[4] LEKES, J.: Slechteni obilovin na uzemi Ceskoslovenska. Brazda, Praha 1997
[5] SASEK, A., CERNY, J., BRADOVA, J.: Rostlinna vyroba 37, 1991 (6-7), s.565
[6] WILLIAMS, J.G.K., et al.: Nucleic Acids Res. 18, 1990, s.6531
[7] Seznam odrud zapsanych ve Statni odrudove knize Ceske republikyk 1.9.1998. Ustredni kontroini azkusebni ustavzemedel-sky Brno, odbor odrudoveho zkusebnictvi, Brno 1998