Золтан Дэмены, Данеля Шмогровичова, Эрнст Штурдик, Петер Гемейнер, Ярослава Паткова. Кафедра биохимической технологии, химико-технологический факультет, Словацкий технический университет, Братислава.
1. Введение
По классической технологии производство пива (брожение вместе с последующим дозреванием) продолжается до 90 дней. Модернизация производства с переходом на однофазовое брожение в цилиндро-конических танках сократила процесс брожения на 18 дней. По классической технологии сусло продувается стерильным воздухом из расчета 5-7 мг кислорода на 1 литр сусла. Такая концентрация сохраняется и в цилиндро-конических танках.
Торговля и конкурентная борьба предъявляют требования к оптимизации экономики производства. Одним из путей достижения этого является непрерывный процесс брожения. Этой проблематике и посвящена публикуемая работа, выполненная на кафедре биохимической технологии химико-технологического факультета Словацкого технического университета и предназначенная для оптимизации процесса брожения в “gas-lift” реакторе.
2.Обзор литературы
Одним из первых, кто применил на практике непрерывную систему брожения, был Велховеров из Новой Зеландии [1]. При непрерывных процессах скорость притока полуфабриката и отвода продукта ограничены величиной критической редуцированной скорости.
Предохранить биомассу от набухания можно опробованным методом иммобилизации биомассы. При использовании иммобилизованных дрожжей следует иметь в виду желательные свойства конечного продукта. Полученное пиво должно иметь аналитические и сенсорные свойства, сравнимые с пивом, полученным по классической технологии.
Поледникова и ее группа [2] вырабатывали 10-процентное пиво при помощи дрожжей, иммобилизованных известковым альгинатом за 7 дней. Кроме наиболее часто применяемого в лабораторной практике иммобилизатора – известкового альгината, используются и другие носители. Линко и Крнлов [3] в своей работе сравнивают органолептические свойства пива, выработанного непрерывным брожением при помощи дрожжей, иммобилизованных различными веществами: от DEAE целлюлозы до пористого стекла. Эти носители лучше подходят, чем известковый альгинат, поскольку окись углерода, образующаяся при брожении, их не разрушает. Из полисахаридов лучшие механические параметры имеет изветковый пектат [4,5].
Нами были исследованы альгинатовые и пектатовые иммобилизаторы в колонке “gas-lift” реактора [6]. Было установлено, что при брожении с помощью иммобилизованных дрожжей нет большой разницы, применяется ли альгинат или пектат, но тип ферментора влияет на скорость разложения сахаридов и возникновения этанола. При иммобилизации альбумином или пектатом остаются проблемы более густой клеточной суспензии.
Повышению живучести дрожжей и течению этаноловой ферментации способствует кислород [7], однако он негативно влияет на аналитические и сенсорные свойства пива. В системе параллельно действующих ферменторов с внутренним рециклингом введение кислорода обусловливает основной профиль летучих составляющих в утилизации аминокислот [8]. При сравнении пива, выработанного классическими методами, и пива, созданного при помощи иммобилизованных дрожжей, содержание ароматических веществ у последних значительно ниже. При введении кислорода во время ферментации значительно снижается концентрация связанных и свободных ароматических веществ, но также уменьшается выработка побочных эфиров и спиртов высшего порядка. Доказано [9], что клетки, несомые альгинатом, осаживают ненасыщенные жирные кислоты высшей концентрации. Изменение продукции частичным снижением метаболической активности клеток и, как следствие, концентрация кислорода с этой точки зрения неблагоприятно сказываются на жизнеспособности дрожжей и на характере сенсорно-активных летучих составляющих пива. По этой причине необходимо в данной ферментационной системе использовать добавки, сочетающие оптимизацию экономических параметров и качество конечного продукта, что и явилось главной целью нашей работы.
3. ОПИСАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА
Микроорганизмы
Мы использовали штамм Saccharomyces cerevisiae W-96 (дрожжи низового брожения). Дрожжевые клетки в медном сосуде, содержавшем глюкозу 10 г/л; (NH4)2 SO4 – 5 г/л; дрожжевой автолизат – 3 г/л; КН2РО4 – 2 г/л; МgSО4•7Н2О – 1 г/л; СаСl2 – 0,1 г/л, NaCl – 0,1 г/л. Поддерживалось pH на уровне 5,8.
Введение носителя
Для иммобилизации мы использовали природный материал полисахаридного типа – калиевый пектат [6]. Использовали суспензию калиевого пектата, произведенного в отделе реализации химического предприятия SAV [10], кислое молоко и воду. В полученную смесь капельно вводили хлористый кальций CaCl2 (C=0,1 mol/l) для образования комочков. Величина комочков регулировалась при помощи притока воздуха через трубку с дюзой, через которую вносились дрожжи. В среде хлористого кальция в переходной фазе раствор-гель происходило замещение K+ионов в пектате ионами Ca2+. Таким образом, растворимый калиевый пектат заменялся на нерастворимую кальциевую соль. В течение 30 минут мы выбирали из потока хлористого кальция комочки геля, которые затем поместили в ферментор. Мы получили комочки с концентрацией биомассы 50,5 г на 1 литр геля. Концентрацию связанной биомассы мы определяли по раствору пектата в виннокислом натрии и калии. Раствор был процежен через бактериологический фильтр, промыт и высушен до постоянных кондиций.
Культивированная среда
Использовалось сусло из пивоварни CODECON, сорт Старый Юр.
Постановка эксперимента.
Ферментация была произведена в “gas-lift” реакторе (рис.1). Рабочий объем ферментора – 486 мл. В качестве носителя мы использовали азот из баллона под давлением, к которому прибавляли кислород необходимой концентрации. Концентрация кислорода контролировалась при помощи кислородного электрода, объем биокатализатора 100 мл, температура ферментации 15°С.
Предпосылки анализа
Определение содержания полифенолов по EBC, определение содержания летучих ароматических веществ по Кельдалю, определение виннокислых белков при помощи красителя Coomassie Brilliant Blue, определение цвета по EBC, установление мнимого и действительного экстракта дистилляцией, определение горькости по EBC, определение этанола и летучих составляющих хроматографом CHROM 5, наполнение колонны 8% FFAP методом head-space, определение аминокислот хроматографом CHROM 5, наполнение колонны в фазе SE 30. Аналитика по Базарову и др. [11]
4. Исследования и дискуссия
Для работы мы выбрали реактор “gas-lift” на основании собственных исследований [6]. При равном общем количестве биомассы в ферменторе, клетками, иммобилизованными известковым пектатом, мы достигли скорости потребления субстрата (rs) 5,15 г/л•ч., в наполненной колонне с перфорированными этажами была rs 4,42 г/л•ч. Скорость производства этанола (rp) в “gas-lift” реакторе 2,21 г/л•ч., а в наполненной колонне с перфорированными этажами 1,91 г/л. В “gas-lift” реакторе на выходе мы установили концентрацию сбраживаемых сахаридов 8,2 г/л, а несбраживаемых 19,1 г/л. Ферментация позволила повысить эффективность биомассы в ферменторе, что дало возможность повысить содержание биокатализатора при сохранении концентрации биомассы в носителе либо повысить концентрацию биомассы в носителе при сохранении количества иммобилизующего материала. При использовании более густой суспензии (биомасса при концентрации свыше 50 г/л) были проблемы в процессе выработки биокатализатора при продавливании через дюзы, поэтому первый вариант с технической точки зрения является более оптимальным.
В работе мы исследовали прирост биомассы в известковом пектате при непрерывном брожении сусла в “gas-lift” реакторе при различных концентрациях окислителя в сусле. В суточных интервалах мы определяли наличие связанных клеток в носителе растворением известкового пектата в винном натриево-калиевом растворе, а также концентрацию свободной биомассы. Эксперименты проводились при различных концентрациях окислителя, а именно: 0, 2, 4 и 6 мг кислорода на литр сусла.
Самый большой прирост биомассы в носителе мы получили в ферменторе при концентрации кислорода 6 мг/л (рис. 2); при увлажнении до концентрации 50,4 г биомассы на литр геля концентрация клеток возросла на 71,3 г/л за 9 дней. Прирост при содержании кислорода в ферментаторе 4 мг/л был меньше, чем при 6 мг/л, но после 14 дней шел быстрее, чем в ферменторе с содержанием кислорода 2 мг/л. Во время ферментации с концентрацией кислорода 2 и 4 мг/л мы добивались 70 г/л геля через 14 дней ферментации. В этих двух случаях концентрация геля не достигала максимума – 73,2 г/л – даже через 28 дней. Без добавления кислорода прирост концентрации связанной биомассы значительно уменьшился и через 28 дней достиг величины 64,8 г/л.
Концентрация кислорода прямо пропорционально влияет на концентрацию свободных бродильных веществ при условии, что речь идет о смешанном ферменторе, т.е. увеличивается содержание их в готовом продукте. В начале ферментации концентрация свободных дрожжевых клеток была нулевой. Она выросла на 0,2 г/л сухого вещества при первом отборе пробы (через 24 часа), и этот прирост оставался постоянным.
Изменение концентрации свободной биомассы мы отмечали в ферменторе с содержанием кислорода 6 мг/л на пятый день ферментации. С этого момента начался прирост биомассы (рис. 3), и на двадцать восьмой день концентрация свободной биомассы составляла 2,1 г/л в фементационной среде. Такой же прирост мы видели и при концентрации кислорода 4 мг/л, но начало прироста биомассы имело место только на восьмой день со значения 0,2 г/л. В этом случае на 15-ый день прирост был практически таким же, как и при концентрации кислорода 6 мг/л. При концентрации кислорода 2 мг/л начало прироста было отмечено на 12-й день, а к концу ферментации прирост достиг величины лишь 1,51 г/л.
В эксперименте без добавления кислорода концентрация биомассы начала возрастать с величины 0,2 г/л на 0,31 г/л в день. Приток субстрата и отвод продукта в каждом эксперименте поддерживались на одном уровне. При притоке субстрата 12,1 мл/час мы достигли концентрации сахаридов 28,9 г/л на выходе из ферментатора. В начале ферментации скорость поступления субстрата составляла 5,34 г/л•час, а скорость выхода продукта 2,35 г/л•час; повышением количества биомассы в ферменторе мы увеличили скорость процесса так, чтобы концентрация сахаридов на выходе составляла 26 – 29 г/л. В эксперименте с концентрацией кислорода 6 мг/л такого состояния мы добились на 10-й день ферментации с притоком субстрата 17,66 мл/час, а в экспериментах с концентрацией кислорода 4 и 2 мг/л на 15-й день ферментации при притоке субстрата 16,94 мл/час. В эксперименте без добавления кислорода этого уровня мы не достигли и на 28-й день, когда окончилась ферментация. Приток субстрата в этом случае составил на 28-й день 14,2 мл/час. Скорости притока субстрата и выхода этанола мы пересчитали на 1 г биомассы. Полученные результаты сведены в таб.1.
Из этой таблицы видно, что кислород определяет скорость переработки субстрата, скорость производства этанола, специфику переработки субстрата в этанол. При этом хорошо видно, что приток субстрата превысил 12,1 мл/час. Причем в эксперименте с содержанием 6 мг/л – на 46%, а в экспериментах при кислороде 2 и 4 мг/л – на 40%, в анаэробном же эксперименте всего на 20%.
Концентрация кислорода кроме параметров брожения обусловливает также и качество конечного продукта. В таб. 2 мы представили данные анализа зависимости главных компонентов качества пива от концентрации кислорода. Водный экстракт – это экстракт сусла на входе в ферментор. Общее содержание этанола в продукте тесно связано с концентрацией кислорода в ферменторе. Экстракт молодого пива имеет такую же тенденцию, что влечет за собой соответствующие изменения в конечном продукте, полученном в результате брожения. Процентное содержание сбраживаемых составляющих нарастает при увеличении концентрации кислорода в сусле. Кислород также влияет и на цвет пива, который получался более темным при более высоких концентрациях кислорода. Горькость пива снижалась при нарастании содержания кислорода.
Наибольшее влияние оказывал кислород на содержание летучих ароматических веществ. Известно, что при использовании иммобилизованных дрожжей возникают проблемы с высоким содержанием летучих ароматических веществ в конечном продукте. При меньшем приросте биомассы изменяется утилизация аминокислот сусла в процессе ферментации. Как видно из таб. 2, концентрация свободных летучих ароматических веществ в молодом пиве существенно уменьшается.
Мы проанализировали концентрацию аминокислот в сусле и в молодом пиве и связали полученные результаты с процентом утилизации аминокислот в сусле. Полученные результаты сведены в таб. 3. Концентрация кислорода в ферменторе не влияет на утилизацию аргинина, эта аминокислота полностью утилизируется при любой концентрации. С повышением концентрации кислорода растет утилизация серина, аспарагина, изолевтина, левтина, лизина, валина, аланина, тирозина, трипторана и гистидина. У защищенных аминокислот – треонина, метионина, фенилалалина и глицина – процент утилизации снижался. Такое же изменение утилизации аминокислот установил и Ван де Винкль и его группа [8] при сравнении ферментационных параметров разных сортов пива в ферменторе с внутренним рециклом субстрата в анаэробном режиме и концентрации кислорода в ферменторе 2 мг/л.
В таб. 4 приведены концентрации сенсорно-активных летучих в молодом пиве. С ростом концентрации кислорода в ферменторе растет и концентрация диацетила в молодом пиве. Повышается и содержание высших спиртов и эфиров: при анаэробном течении в соотношении 5,4:1; при концентрации кислорода 2 мг/л – 5,6:1, при 4 и 6 мг/л – 6,7:1. Изменение концентрации этих сенсорно-активных летучих было исследовано и в работе Ван де Винкля [8], причем в ферменторе с концентрацией кислорода это соотношение указано 11:1, а в анаэробном эксперименте 2,4:1.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании установленных нами параметров ферментации при брожении в “gas-lift” реакторе кислород, добавляемый к притоку сусла, дает следующие результаты. Влияние кислорода на дальнейшие свойства конечного продукта, особенно на содержание свободных ароматических веществ, имеет позитивный характер. Мы установили негативное влияние кислорода на сенсорно-активные летучие. Следствием высоких концентраций кислорода было возникновение повышенного содержания диацетила и повышение соотношения высших спиртов и эфиров. Следует заметить, что на выходе ферментора содержится 8,2 г/л сбраженных сахаридов, поэтому следует дображивать продукт после ферментора. При дображивании сказывается действие диацетила на изменение концентрации сенсорно-активных летучих. На основании произведенных исследований мы делаем вывод, что в начальной фазе ферментации целесообразно вести процесс при содержании кислорода 6 мг/л. После 10 дней при насыщении носителя биомассой можно снизить степень аэрации до меньших значений.

Литература:
1. HARDWICK, W.A.: Handbook of Brewing, (Marcel Decker Inc.) New York, 1995
2. POLEDNIKOVA, M., et al.: Kvasny Prum. 39, 1993, s.2
3. LINKO, M., KRONLOF, J.: Proc. Eur. Brew. Conv., 23rd Congress, Lisbon. (1991)
4. GEMEINER, P., et al.: Biotechnol. Appl. Biochem. 13, 1991, s. 335.
5. TOMASKA, M., et al.: Biotechnol. Appl. Biochem. 21, 1995, s. 347.
6. SMOGROVICOVA, D. et al.: Biotechnol. Techn. 11, 1997, s. 261.
7. HAMAMCI, H., RYU D.D.Y.: App. Microb. Biotech. 28, 1988, s.515.
8. VAN DE WINKEL, L., et al.: Proc. Eur. Brew. Conv., 24th Congress, Oslo, 1993, s. 307.
9. MASSCHELEIN, C.A.: Biotechnology Application in Beverage Production, Cantarelli, G., Lanzarini, G., Eds., 1989, s.77.
10. An.: List of products. Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences, 1995, s. 18.
11. BASAROVA a kol.: Pivovarsko-sladarska analytika (Merkanta) Praha, 1992.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *