РОЛЬ АМИНОКИСЛОТ И ВЫСШИХ СПИРТОВ ПРИ НЕФЕРМЕНТАТИВНОМ ОКИСЛЕНИИ ПИВА

Инж.,д.т.н. Ян Шавел; инж., к.т.н. Дана Здвихалова; национальное предприятие «Будейовицкий Будвар», Ческе Будейовице
1. Введение
Нeферментативное окисление основных биохимических соединений притягивает внимание научных сотрудников, так как оно может быть причиной старения живых организмов и пищевых продуктов. Старение обычно связано с окислительно-восстановительными реакциями, в основном с так называемыми активными формами кислорода (reactive oxygen species), например со свободными радикалами кислорода (oxygen free radicals) [1, 2].
Активные формы кислорода и его радикалы могут образоваться в результате ферментативных и неферментативных реакций, при старении пива (некоторые реакции этого процесса были описаны еще до подробного изучения радикальных реакций кислорода).
Наиболее известными окислительными реакциями при старении пива считают меланоидиновое окисление высших спиртов в присутствии аминокислот, расщепление аминокислот по Стрекеру, реакцию Фентона, фотоокислительные реакции и окисление высших спиртов в присутствии полифенолов [3].
Образование высших спиртов при брожении заключается в превращении аминокислот, при этом первоначально образующиеся альдегиды восстанавливают ферменты дрожжей до спиртов. При старении пива аминокислоты и спирты могут снова окисляться до альдегидов, которые придают пиву в ряде случаев характерный запах и привкус, либо эти альдегиды могут служить по крайней мере индикаторами старения.
Реакция Малларда может препятствовать образованию радикалов при одновременном потреблении растворенного кислорода, чем объясняется ее окислительный и восстановительный характер [4]. По мнению авторов этой работы, для окисления компонентов пива достаточно комплекса реакций, начинающихся со взаимодействия кислорода с водой в кислой среде [5].
О радикальных реакциях свидетельствуют измерение интенсивности естественной хемилюминесценции пива и изучение спектра электронно-спинового резонанса (ESR) [6, 7]. В качестве ингибитора окисления обычно выбирают материал, способный погасить радикальную реакцию кислорода. Изучению ингибиторов окисления сегодня придается особенно большое значение, об этом свидетельствует заключение, сделанное на конференции о свободных радикалах и ингибиторах окисления, проходившей в Швейцарии в 1992 г. [2]. По мнению медицинских работников, данные об антиокислительных свойствах необходимо приводить на этикетках продовольственных товаров вместе с данными об энергетической ценности продукта.
Как было установлено ранее, старение пива можно ускорить, добавляя водные растворы пероксодисульфатов [8]. При этом из этих веществ сначала образуется озон, который затем вступает в реакцию с органическими соединениями, образуя синглетный кислород, что можно подтвердить измерением интенсивности хемилюминесценции [9]. Крайне чувствительными при реакции с активными формами кислорода являются аминокислоты и спирты [10].
Пиво — это богатая смесь соединений, включающая сахара, аминокислоты, полифенолы, спирты, горькие материалы и небольшое количество липоидов. Практически все соединения могут вступать в реакцию с радикалами кислорода с образованием как активных, так и неактивных соединений.
Ранее мы продемонстрировали способность фенилаламина и 2-фенилэтилового спирта подавлять окисление, предлагая в качестве ингибиторов окисления, например, феруловую кислоту, полифенольные вещества, водные экстракты хмеля, сусла или чая. Удивительно хорошим ингибитором окисления оказался этиловый спирт [10].
2. Материалы, методы и приборы
2.1. Химические реактивы и подготовка растворов
Пероксодисульфат калия, 2-фуральдегид, глюкоза, мальтоза, ксилоза (MERCK, SRN), 2-фенилэтаноловый спирт, 2-фуриловый спирт, бензиловый спирт, феруловая кислота, гидрат (+)-катехина, аскорбиновая кислота, DL-фенилаланин, L-цистеин (FLUKA, Швейцария), этиловый спирт 96,5% тонкой очистки (Lihovar Chrudim, Чешская Республика). Растворы всех материалов готовили, растворяя их в дистиллированной воде, исключением был раствор аминокислот для приготовления меланоидина (см. п. 2.3).
2.2. Растворы ингибиторов окисления
Экстракты хмеля и чая (С = 2,5 г•л-1) готовили в соответствии с работой [10]. В качестве потенциальных ингибиторов окисления были протестированы водные растворы феруловой кислоты (с = 200 мг•л-1), цистеина (с = 20 мг•л-1), (+)-катехина (с = 200 мг•л-1), аскорбиновой кислоты (с = 50 мг•л-1) и этилового спирта (с = 10 объемных %).
2.3. Раствор меланоидинов
В 1 л водопроводной воды растворили 80 г мальтозы, 20 г глюкозы, 150 мг ксилозы и смесь аминокислот суммарной концентрацией 1000 мг•л-1 [11]. Подробный состав смеси аминокислот и их происхождение приведены в работе [11]. После урегулирования величины рН фосфорной кислотой и едким натром (с = 0,5 моль л-1) до значения рН = 5,5 смесь кипятили в течение 2 ч. на воздухе в открытой нержавеющей емкости, доливая воду до первоначального объема.
2.4. Окисление фурфурилового спирта и фурфурола в дистилляционном тесте
К 100 мл раствора фурфурилового спирта (с = 5 мг•л-1) или фурфурола (с = 10 мг•л-1) добавили 0,2 и 2,0 мл раствора пероксодисульфата калия (с = 5%) и через смесь пропустили водяной пар. После добавления в дистиллят 100 г дистиллированной воды определяли спектр поглощения проб по сравнению со спектром воды. Одновременно получили спектры поглощения растворов обоих веществ в дистиллированной воде при одинаковой концентрации (рис.1).
2.5. Дистилляционный контроль антиоксислительных свойств
К 50 мл раствора фурфурола (с = 10 мг•л-1) добавили 50 мл раствора ингибитора окисления в соответствии с п.2.2, 0,2 мл пероксодисульфата калия (с = 5%) и через смесь пропустили водяной пар. После добавления в дистиллят до 100 мл дистиллированной воды определили спектр поглощения (рис.2).
2.6. Окисление высших спиртов в водной среде в присутствии этилового спирта
Для подтверждения изменения поглощающей способности при окислении высших спиртов непосредственно в водном растворе при температуре пастеризации к 200 мл водных растворов высших спиртов (с = 100 мл.л-1) добавили 0,4 мл раствора пероксодисульфата калия (с = 5%) и полученный раствор нагрели до 60°С. К такой же серии проб перед нагревом добавили этиловый спирт с конечной концентрацией 5 объемных %. Перед нагреванием и после него определили спектр поглощения проб (рис.3, 4).
2.7. Кинетика образования мутности при окислении фенилаланина и 2-фенилэтилового спирта
К 200 мл раствора фенилаламина и 2-фенилэтилового спирта (с = 50 мл•л-1) добавили 0,4; 4 и 40 мл раствора пероксодисульфата калия (с = 5%) и раствор нагревали в течение времени от 0 до 24 ч. при температурах 40-80°С. Измерение мутности проб проводили в интервалом в 2 ч. (рис. 5, 6).
2.8. Хемилюминесцентный тест
К пробам отдельных соединений пива и пивоваренных субстратов добавили раствор пероксодисульфата калия и сразу же после перемешивания начали измерять интенсивность хемилюминесценции при температуре 45°С в зависимости от времени на люменометре BioОrbit 1251 (рис.7, 8). Измерения проводили в Биофизическом институте Чешской Академии наук, Брно (Д-р Чиж, д-р Лойек).
2.9. Изменение спектра поглощения меланоидинов при хранении
После пропускания через только что приготовленный водный раствор меланоидинов водяного пара с добавлением пероксодисульфата калия (с = 0,1%) и без него регистрировали спектр поглощения дистиллята. Затем раствор меланоидинов хранили с добавлением этилового спирта (с = 5 объемных %) и без него в течение 3-х дней при температуре 5 и 50°С. Затем через смесь снова пропускали водяной пар и снова записывали спектр дистиллятов (рис.9).
2.10. Пропускание водяного пара
При пропускании водяного пара через 100 мл проб из пп.2.4, 2.5 и 2.9 в течение 10 мин. отогнали 50 мл дистиллята и после добавления дистиллированной воды до 100 мл записали спектр поглощения по сравнению со спектром дистиллированной воды.
2.11. Используемые приборы
Значения поглощающей способности и спектры поглощения измеряли при помощи спектрофотометра CADAS 100 (Д-р Б.Ланге, SRN) в 1 см кварцевой кювете, используя программу PCSCAN, с интервалом измерений 1 нм. Мутность измеряли с помощью мутномера LTP 6В (Д-р Б. Ланге, SRN).
3. Обсуждение результатов
Окисление фурфурилового спирта и фурфурола в дистилляционном тесте подтвердило быстрое разложение обоих соединений и при относительно низких концентрациях пероксодисульфата калия. При этом при окислении фурфурилового спирта не обнаружено спектра поглощения фурфурола, что свидетельствует о дальнейшем разложении этого соединения. Для сравнения записали спектр поглощения водных растворов фурфурилового спирта и фурфурола перед пропусканием водяного пара (рис.1).
В пиве обычно можно обнаружить фурфурол, при этом его содержание увеличивается при старении, что используют для подтверждения термического старения пива. Объяснение этому можно найти в действии антиокислительных веществ, содержащихся в пиве, которые сильно подавляют окислительное воздействие пероксодисульфата калия (рис.2). Ингибиторы окисления действуют приблизительно таким же образом, как при окислении фенилаланина и фенилэтилового спирта [10].
РОЛЬ АМИНОКИСЛОТ И ВЫСШИХ СПИРТОВ ПРИ НЕФЕРМЕНТАТИВНОМ ОКИСЛЕНИИ ПИВА
Помимо образования фурфурола при кислотном разложении необходимо принять во внимание и то, что фурфурол образуется и при окислении фурфурилового спирта активными формами кислорода, потому что фурфуриловый спирт в пиве имеется в достаточном количестве [12]. Проверить это можно при наблюдении за содержанием фурфурилового спирта в процессе старения пива.
Для проверки антиокислительного действия этилового спирта в водном растворе проводили окисление фенилэтилового спирта, бензилового спирта и фурфурилового спирта в присутствии этилового спирта. Этиловый спирт частично подавляет окисление фурфурилового спирта, антиокислительное воздействие этилового спирта в фенилэтиловом и бензиловом спиртах подтвердилось снижением максимума поглощающей способности при длине волны 250 нм, которая соответствует образованию бензальдегида (рис.3, 4).
При окислении фенилаланина и фенилэтилового спирта больших концентраций появляется мутность, которую можно использовать для проверки антиокислительного действия различных веществ [10]. Условия образования мутности и ее изменение приведены на рис. 5 и 6. При температуре 40°С мутность появляется при относительно высокой концентрации (1%) пероксодисульфата калия, в то время как при 80°С и такой же концентрации мутность уже исчезает. Интересно также сходство кинетики образования и исчезновения мутности у фенилаланина и фенилэтилового спирта, из чего следует, что поведение обоих соединений при окислении связано с основным строением ароматической молекулы аминокислот и лишь небольшое влияние на него оказывает функциональная группа боковой алифатической цепочки. По этой гипотезе, аминокислоты и высшие спирты будут такими же хорошими мишенями для активной формы кислорода. Однако эту гипотезу необходимо проверить в дальнейших исследованиях. Кроме того, необходимо предположить богатый спектр активных веществ в аминокислотах, которые присутствуют в пиве в большом количестве разновидностей и в более высокой концентрации, чем соответствующие высшие спирты.
В предыдущих исследованиях установлено, что этиловый спирт также подавляет образование мутности в этой реакции. Промежуточным продуктом окисления в реакции образования мутности является бензальдегид, что подтверждено сравнением его спектра поглощения и анализом продуктов окисления с помощью комбинации хроматермографии и масс-спектрометрии [13]. В соответствии с этим образование мутности можно вызвать окислением бензилового спирта и бензальдегида. Главным продуктом при окислении фенилаланина и фенилэтилового спирта является фенилацетальдегид.
Образование бензальдегида из фенилаланина представляет собой важную теоретическую проблему, потому что означает сокращение углеродистой цепочки на боковую метиленовую группу. Мы предположили, что это сокращение происходит в результате радикальных реакций и можно ожидать и образования следующих, относящихся к меньшинству соединений.
Результаты также говорят о простых моделях окисления аминокислот и высших спиртов, при этом необходимо учитывать образование различных продуктов при их последующем разложении на более простые, в конце концов на двуокись углерода и воду. Эти реакции могут в различном диапазоне замедлять окисление других веществ, таких, как полифенолы, а также и сами аминокислоты и высшие спирты.
Понятие ингибитор окисления затем становится относительным, потому что от цели окислительной реакции зависит, какая аминокислота или какой спирт будет ингибитором окисления в данной реакции. От свойств продукта окисления будет также зависеть значение ингибитора окисления. До сих пор понятие ингибитора окисления обозначало вещество, которое препятствовало образованию нежелательного продукта окисления или разложению желаемого вещества.
В технологическом смысле слова ингибитором окисления считают любое вещество, препятствующее нежелательным, потребительски известным изменениям товара под влиянием окисления.
Антиокислительное действие могут проявлять и отдельные вещества, например этиловый спирт или фенилаланин, которые блокируют окислительные реакции, образуя нежелательные соединения, например ацетальдегид или бензальдегид, в области ниже значения порога чувствительности.
При старении пищевых продуктов решающими являются окончательные изменения пищевого продукта, которые могут включать и образование веществ, образующихся из соединений, специфических только для данного продукта. К этому приводит окисление обычно присутствующих составляющих, например аминокислот, при этом окислительно-восстановительные реакции влияют друг на друга в разном диапазоне.
За идеальный ингибитор окисления можно принять вещество, максимально сильно замедляющее окислительные реакции, при этом их собственные продукты окисления не имеют значительной активности. Ряд исследований подтвердил значительные изменения выбранных аминокислот при старении пива [14, 15]. Степень окислительного действия, очевидно, зависит от разновидности реактива, как, например, при фотоокислении пива образуется специфический привкус и запах, в отличие от типичного вкуса.
Полезным методом исследования радикальных реакций является хемилюмимнесценция. При изучении антиокислительных реакций обычно образование радикалов индуцируется нагревом подходящих неорганических или органических соединений, а затем исследуют действие ингибиторов кислорода при затухании хемилюминесценции.
При тестировании влияния добавок растворов пероксодисульфатов было получено доказательство увеличения интенсивности хемилюминесценции в зависимости от разновидности промежуточного продукта при производстве пива (рис.7). После добавления пероксодисульфата увеличилась интенсивность хемилюминесценции сусла, охмеленного сусла и пива, практически без изменений остался водный экстракт хмеля. Антиокислительное действие хмелевого экстракта было хорошо видно, а поэтому вещества хмеля можно считать подходящими ингибиторами кислорода.
При этом увеличение хемилюминесценции было наибольшим у пива. Пероксодисульфат, таким образом, можно считать соединением, имеющим способность усиливать естественную хемилюминсценцию пива и промежуточных продуктов. Этим методом можно измерять окислительное и антиокислительное действие разных веществ, согласно этому можно или ослабить, или, наоборот, усилить естественную хемилюминесценцию пива, или даже установить, какие вещества могут вызвать люминесценцию.
После измерения хемилюминесценции отдельных составляющих пива с добавлением раствора пероксодисульфата калия оказалось, что меланоидные вещества проявляли естественную хемилюминесценцию, которая усиливалась после добавления пероксодисульфата (рис.8). Из рисунка также хорошо видна разница в большем нарастании хемилюминесценции у пива, которое хранилось в течение 1 года. Высокую хемилюминесценцию также показал раствор меланоидинов, при этом вид кривой хемилюминесценции несколько изменился при добавлении этилового спирта.
На способность меланоидинов окислять высшие спирты обратил внимание уже Хашимото [16]. Можно предположить и их возможное окислительное воздействие на аминокислоты, при этом интенсивность воздействия будет зависеть от разновидности меланоидиновых веществ, которые теоретически могут образоваться из разных видов аминокислот и сахаридов, при этом можно применять и антиокислительную способность некоторых аминокислот, остающихся в первоначальной смеси. Таким образом, можно объяснить окислительные и антиокислительные свойства меланоидинов в смеси с аминокислотами. Старение пива можно объяснить уменьшением антиокислительных свойств пива. В соответствии с этим удалось подтвердить образование летучих веществ, абсорбирующих в ультрафиолетовом свете после хранения раствора мелоноидинов при высокой температуре (рис.9). При этом образование таких веществ не замедляет добавление этилового спирта в отличие от окисления фенилаланина.
4. Заключение
В результате окисления растворов аминокислот и высших спиртов пероксодисульфатом калия эти соединения могут легко подвергаться влиянию активных форм кислорода. Ход окислительных реакций очень сложен, при этом, по всей вероятности, осуществляются радикальные реакции, способствующие образованию разных соединений. Эти переходные продукты могут подвергаться последующему окислению.
Чувствительность фурфурилового спирта и фурфурола к окислению можно использовать для изучения окислительного и антиокислительного действия различных веществ, потому что их разрушение можно легко наблюдать спектрофотометрическим методом после пропускания через них водяного пара.
Окислительную реакцию можно подавить, используя ингибиторы окисления. Хотя некоторые из них замедляют окислительные реакции, но одновременно могут подвергать соединения разложению с образованием новых, нежелательных соединений. Отсюда следует, что можно аминокислоты и высшие спирты одновременно считать биохимической «мишенью» окисления, а некоторые из них и ингибиторами окисления.
Чувствительность пива к окислительным реакциям можно исследовать измерением интенсивности хемилюминесценции после добавления раствора пероксодисульфата калия. Это вещество усиливает естественную хемилюминесценцию пива, и реакцию можно использовать для измерения антиокислительного действия отдельных составляющих пива. Значительный антиокислительный эффект проявил водный экстракт хмеля.
Измерение интенсивности хемилюминесценции меланоидинов после добавления раствора пероксодисульфата калия показало окислительную способность меланоидных веществ. Мы предполагаем, что меланоидные вещества могут окислить аминокислоты с образованием летучих, активных веществ, при этом присутствие свободных аминокислот в растворе может оказать влияние на окончательный эффект окисления. При хранении раствора меланоидинов при высокой температуре удалось подтвердить образование летучих веществ. Мы предполагаем, что старение пива основано на окислительном воздействии меланоидиновых веществ на аминокислоты и спирты, при этом постепенное уменьшение антиокислительной способности делает более выразительными его изменения.
Литература
[1] PUNCHARD, N.A., KELLY, J.F.: Free radicals — a practical approach. Oxford University Press, New York 1996.
[2] CADENAS, E., PACKER, L.: Hanbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 1996.
[3] BAMFORTH, C.W., MULLER, R.E., WALKER, M.O.: J.Am.Soc.Brew.Chem.51, 1993, s.79.
[4] ZEISE, S., KLEIN, J., KROH, L., STROESSER, R.: Strategies for food quality control and analytical methods in europe. Proc. 6.Eur.Conf.Food Chem. Hamburg, 1991, s.280
[5] SELLES, J.F.: Techn.Quart. MBAA 34, 1997, s.249.
[6] KANEDA, H., KANO, Y., KAMIMURA, M.: J.Inst.Brew.97, 1991, s.105.
[7] UCHIDA, M., SUGA, S., ONO, M.: J. Am.Soc.Brew.chem.54, 1996 s.205.
[8] SAVEL, J., PROKOPOVA, M., XDVEHALOVA, D.,: Kvasny Prum. 41, 1995, s. 374.
[9] KANOFSKY,J.R., SIMA, P.: J. Biol. Chem. 266, 1991 s.9039.
[10]SAVEL, J., J., ZDVIHALOVA, D.: Kvasny Prum.44, 1998, s.171.]
[11]SAVEL,J.,ZDVIHALOVA, D., PROKOPOVA,M.: Kvasny prum.44, 1988, s 40.
[12]MOLL,M.: Beers and coolers. Andover, Hampshire 1994, Velka Britanie
[13]VELISEK, J.: osobni sdeleni.
[14]THUM, B., MIEDANER, H., NARZISS, L., BACK, W.:Proc.Eur.Brew.Conv.Congr.1995, s 499.
[15]HILL, P.,LUSTIG, S., SAWATZKI, V.: Mschr.Brauwiss.51, 1998, s.499.
[16]HASHIMOTO, N., ESHIMA, T.: J. Am.Soc.Brew.35, 1997, s.145.