Золтан Доменый, Даниэла Шмогровичова, Эрнест Штурдик, Ярослава Пяткова, Кафедра биохимической технологии, Химико-технологический факультет, Словацкий технический университет, Братислава, Словацкая Республика
1. Введение
Изготовление низкоалкогольного пива уже давно является проблемой в пивоваренном производстве. Требования потребителя к вкусовым качествам здесь такие же, как и у классического пива, но содержание алкоголя должно быть уменьшено из законодательных и медицинских соображений. Производство пива с низкой концентрацией алкоголя требует изменения в технологическом процессе. На практике чаще всего применяется два способа: проведение брожения таким образом, чтобы в продукте концентрация алкоголя оказалась ниже требуемой концентрации, или же сепарация алкоголя из пива, произведенного по классической технологии с помощью мембранных процессов. Однако существуют опыты по производству низкоалкогольного пива при помощи иммобилизации дрожжей и при помощи генетических манипуляций с дрожжами.
2. Обзор литературы
Если ранее иммобилизационные системы использовали только при изготовлении пива на опытных производствах, то сейчас их используют при промышленном производстве пива. Широко известно их основное применение при дображивании пива [1]. Эти системы были протестированы также и при производстве низко- и безалкогольного пива. В производстве применяют бродильные чаны с перфорированными этажами, где в качестве носителя используется целлюлоза DEAE. Такое оборудование применяют в Голландии и Дании. Для производства безалкогольного пива применяют и биореактор с внутренней циркуляцией субстрата, где дрожжи иммобилизированы в кремниево-углеродном носителе [2]. Произведенное таким образом пиво содержит алкоголь в диапазоне 0,5-0,1 об.%, однако отличается умеренным привкусом дрожжей и сильным запахом. Помимо двух вышеприведенных носителей для производства низкоалкогольного пива использовали и дрожжи, иммобилизированные до спеченного макропористого стекла [3] с диаметром шариков 1-2 мм и пористостью до 55%. Брожение проходит в жидкостном реакторе, и время выдержки продукта составляет 1 час. Полученное таким образом пиво продегустировали и сравнили с пивом, полученным по классической технологии «стоп-брожения». Четыре дегустатора на первое место поставили пиво классическое, а трое однозначно отдали предпочтение пиву, произведенному по новой технологии. Преимущества производства низкоалкогольного пива заключаются главным образом в регулировании параметров брожения [4], что обусловливает вкусовые качества и аналитические свойства готового продукта. Регулированием скорости течения и скорости разбавления, температуры брожения и количества биомассы можно достичь баланса отдельных параметров готового продукта. Полисахаридные носители, такие, как альгинат и пектат кальция, можно с успехом применять при производстве классического пива периодическим и непрерывным способом [6]. При непрерывном брожении охмеленного сусла в «газ-лифт» реакторе и в наполнительной колонке сравнивали шарики альгината и пектата с иммобилизационными дрожжами [6]. Из приведенных носителей с точки зрения высокой механической стабильности предпочтение отдается пектату кальция [7]. Однако до сих пор при производстве низкоалкогольного пива пектат кальция в качестве иммобилизационного материала не использовали. Целью настоящей работы являлось тестирование пектатового геля с иммобилизационными дрожжами, который уже был опробован в лабораторных условиях с непрерывным брожением охмеленного сусла, для производства пива [6].
3. Описание экспериментального производства
Микроорганизм. Использовали сборный штамм, Saccharomyces cerevisiae W-96 (дрожжи низового брожения), удерживаемый на агаре с частотой пересева 1 месяц. Клетки дрожжей размножались в жидкой среде, содержащей: глюкозу (с = 10 г/л); (NH4)2SO4 (c = 5 г/л); автолизат дрожжей (с = 3 г/л); KH2PO4 (с = 2 г/л); MgSO4•7H2O (с = 1 г/л); CaCl2 (с = 0,1 г/л); NaCl ( с = 0,1 г/л); значение pH равнялось 5,8; условия стерилизации: 120 кПа, 20 минут при температуре 120°С.
Подготовка носителя. Для иммобилизации использовали натуральный материал полисахаридного типа – пектат калия [6]. Суспензию готовили из пектата калия, произведенного в Отделении реализации Химического института Словацкой Академии наук [8], дрожжевого молочка и воды. Из приведенных компонентов получили вязкую массу, которую по каплям подавали в раствор CaCl2 (с = 0,1 моль/л), и получали шарики. Размер шариков регулировали с помощью потока воздуха через трубу с форсункой, из которой выдавливали вязкую массу носителя и дрожжи. В растворе хлорида кальция осуществлялся золь-гель переход заменой ионов К+ в пектате ионами Са2+. Таким образом растворимый пектат калия заменяется нерастворимой солью кальция. Частицы геля оставили в растворе CaCl2 на 30 минут, а затем их перенесли в бродильный чан. Были изготовлены шарики с концентрацией биомассы 51,7 г сухого остатка на 1 л геля. Концентрацию связанной биомассы определили после растворения пектата в тартрате натрия-калия. Раствор профильтровали через бактериологический фильтр, вымытый и высушенный до постоянной массы.
Культивированная среда. 12-процентное охмеленное сусло, сгущенное до концентрации экстракта 24% с помощью вращающегося вакуумного выпарного аппарата.
Осуществление опытов. Брожение осуществляли в системе реакторов, соединенных, как показано на рис.1. Главное брожение проводили в «газ-лифт» реакторе (который состоит из двух труб – труба в трубе, – несущий газ подводится снизу по внутренней трубе и перемешивает содержимое бродильного чана) с помощью свободных клеток (концентрация в установившемся состоянии 5,1 г/л). Рабочий объем бродильного чана составлял 492 мл. В качестве несущего газа использовали профильтрованный воздух. После основного брожения молодое пиво поступало в отстойник, а оттуда в колонку для дображивания. Рабочий объем чана для дображивания составил 800 мл, объем биокатализатора 600 мл. Концентрация кислорода, за которой наблюдали с помощью кислородного электрода, составила в колонке главного брожения 4 мг/л, а на входе в колонку для дображивания 0,8 мг/л, температура брожения составила 15°С.
Аналитические методы. Общие полифенолы согласно ЕВС, азотсодержащие соединения согласно Келдала, белковый азот с помощью красителя СВВ (comassi brilliant blue), цвет согласно ЕВС, горечь согласно ЕВС, мнимый и истинный экстракт, полученный дистилляцией, этиловый спирт и летучие составляющие газовой хроматографией (CHROM 5, наполнительная колонка 8% FFAP методом head-space), аминокислоты газовой хроматографией (CHROM 5, наполнительная колонка фаза SE 30). Все процессы были реализованы Басаржовой с коллегами [9].
4. Обсуждение результатов
При работе использовали систему, которая состояла из серийно изготовленного «газ-лифт» реактора и наполнительной колонки. Главное брожение проводили при помощи свободных клеток с концентрацией в установившемся состоянии 5,1 г сухого остатка на 1 л в «газ-лифт» реакторе при времени выдержки охмеленного сусла 12,4 ч. Этот бродильный чан работал в аэробных условиях, концентрация растворенного кислорода составляла 4 мг/л. Молодое пиво из верхней части колонки поступало в отстойник, где непрерывно отделяли 92% сухого остатка дрожжей. После отстоя молодое пиво перевели в колонку для дображивания с иммобилизационными дрожжами, суммарная продолжительность выдержки пива в колонке для дображивания составила 96,4 ч. В качестве исходного сырья использовали 12-процентное охмеленное сусло, сгущенное до 24%. Пробы отбирали с интервалом 24 ч. до и после дображивания и разбавляли дистиллированной водой (1:1) до первоначальной концентрации экстракта. Для разбавления использовали дистиллированную воду, которую затем не очищали. Для сравнения использовали готовое алкогольное пиво с концентрацией первоначального экстракта 24%, брожение которого проводили шихтовым методом в закрытой посуде с дрожжами, иммобилизированными в пектате кальция. Отношение массы геля и среды брожения составляло 1:9. Концентрация клеток в носителе была тождественна концентрации клеток в чане для дображивания. Брожение составило 13 дней при температуре 15°С, а готовое пиво разбавили дистиллированной водой в соотношении 1:1. Для сравнения анализировали пиво, полученное из того же охмеленного сусла классическим способом в ЦKT. Результаты непрерывного процесса в установившемся состоянии обработали статистически, среднее арифметическое всех измерений приведено в таб. 1. Система работала в установившемся состоянии 35 дней.
Параметры молодого и дображенного пива, а также сравнительных проб, приведены в таб. 1. Истинный экстракт сравниваемого пива в два раза больше истинного экстракта дображенного низкоалкогольного пива. Это связано с различием в величинах истинного сбраживания. Что касается этилового спирта, то его концентрация в молодом пиве после «газ-лифт» реактора составляет 0,3 об.%. Такая низкая концентрация вызвана большим возрастанием биомассы в реакторе в результате воздухововлечения с концентрацией кислорода 4 мг/л. В колонке для дображивания с иммобилизационными дрожжами концентрация этилового спирта возросла до 0,8 об.%. Что касается концентрации этилового спирта в сравнительных пробах, при шихтовом брожении иммобилизационными дрожжами и в пробе из ЦКТ ее значения были соответственно 4,37 и 4,08. За все время брожения концентрация клеток в общем объеме бродильного чана увеличилась в случае иммобилизационных дрожжей на 5,2%, а в случае ЦКТ на 11,7%. При непрерывном брожении в «газ-лифт» реакторе концентрация дрожжей увеличилась в 2,23 раза за 12 часов брожения. Из этих результатов можно сделать вывод, что сахариды при главном непрерывном брожении используют для образования биомассы. Это подтверждает и низкая концентрация свободных и связанных азотсодержащих соединений в молодом пиве. Уменьшение концентрации азотсодержащих соединений уже при непрерывном дображивании с помощью иммобилизационных дрожжей мало. Наибольшая концентрация азотсодержащих соединений наблюдалась в контрольном пиве, брожение в котором проводили с помощью иммобилизационных дрожжей шихтовым способом.
Помимо основных параметров отдельных проб был определен и профиль некоторых летучих веществ (таб.2). Концентрация н-пропилового спирта в низкоалкогольном пиве составляла только третью часть концентрации в контрольной пробе, брожение которой проходило в ЦКТ. Однако эта концентрация была на порядок выше, чем, например, в пиве «Haake Beck» [3]. Концентрация 2-метилпропилового спирта была одинаковой в каждой пробе, а концентрация 2- и 3-металбутанола в низкоалкогольном пиве была в 2 раза больше, чем в контрольных пробах. Что касается эфиров, то концентрация этилформиата была наибольшей в молодом пиве, при дображивании она снизилась в 2 раза, но и эта концентрация была выше, чем в сравнительных пробах. Аналогичным образом можно охарактеризовать и разницу в содержании 3-метилбутилацетата. Из декетонов была определена концентрация диацетила. После главного брожения молодое пиво содержало 0,68 мг/л, но в процессе дображивания содержание диацетила снизилось до 0,19 мг/л, причем эта концентрация находилась между значениями, определенными в контрольных пробах.
Была проанализирована и концентрация аминокислот в охмеленном сусле, которое использовали при брожении в отдельных пробах, и их содержание выразили в процентах утилизации (таб.3).
В безалкогольном пиве были утилизованы весь L-аргинин, L-серин и L-треонин в отличие от сравнительных образцов, где только L-аргинин был утилизован на 100%. Аналогичную степень утилизации, как у контрольных проб, получил Ван де Винкель с коллегами [10] при оценке параметров пива, полученного непрерывным брожением в бродильном чане с внутренней циркуляцией субстрата.
5. Заключение
В работе была проверена система, состоящая из серийно изготовленного «газ-лифт» реактора и из наполнительной колонки для производства низкоалкогольного пива. После выдержки в течение 106 ч. в системе реакторов при 15°С было изготовлено низкоалкогольное пиво с содержанием этилового спирта 0,8 об.%. Концентрация чувствительно активных веществ была такая же, как у контрольных проб. Содержание свободных и связанных азотсодержащих соединений было ниже. У приготовленного пива присутствовал в основном сильный фруктовый запах, что могло быть вызвано большой концентрацией этилформиата и 3-метилбутилацетата. Молодое пиво после главного брожения содержало 5,1 г сухого остатка дрожжей на 1 л, из чего 92% биомассы было сепарировано перед входом в колонку для дображивания. Эти дрожжи в пивоваренном производстве могут частично заменить обычно применяемые дрожжи. Вкусовые качества приготовленного пива были оценены десятью обычными потребителями. Семь из них посчитали, что произведенное низкоалкогольное пиво сравнимо с контрольными пробами, а троим не понравился фруктовый запах и разница во вкусе, вызванная низкой концентрацией этилового спирта.
Литература
[1] WACKELBAUER R.K., FITZNER M., GIENTHER, J.: Brauwelt 136, 1996 (45), s.2140
[2] VAN DE WINKEL, L., VAN BEVEREN, P.C., MASSCHELEIN, C.A.: Proc.Eur.Brew.Chem.Conv., 1991, s.574
[3] AIVASIDIS, A., ET AL.: Proc.Eur.Brew.Chem.Conv.,1991, s.569
[4] SNEVEN, A.H., POWER, J., RYDER,D.S.: Brew.Digest, 1991 (1), s.44
[5] POLEDNIKOVA, M., et al.: Kvasny Prum., 39, 1993, s.2
[6] SMOGROVICOVA, D., et al.: Biotech. Tech., 4, 1997, s.261
[7] GEMEINER, P., et al.: Biotechnol. Appl.Biochem. 13, 1991, s.335
[8] An.: List of products. Inctitute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences, 1995, s.18
[9] BASAROVA, G.et al.: Pivovarsko — sladarska analytika (Merkanta) Praha, 1992
[10] VAN DE WINKEL L., et al.: Proc.Eur.Brew., Chem.Conv., 1993, s.307